FIGURA 1-1
Origem embriológica do pâncreas e ilhotas. Um primórdio dorsal e um ou dois primórdios ventrais formam-se a partir do intestino primitivo (A) e se fundem posteriormente (B) [1]. O primórdio ventral forma a cabeça do pâncreas e tem ilhotas ricas em polipeptídios pancreáticos com poucas ou nenhuma célula A. O primórdio dorsal forma a porção principal do pâncreas, que constitui o cauda, corpo e parte da cabeça; aqui, as ilhotas são ricas em glucagon e pobres em polipeptídio pancreático. Grosso modo, as células A e PP se substituem mutuamente em número (15%–25% das células de ilhota) enquanto as percentagens de células b (70%–80%) e células D (5%) permanecem iguais.

FIGURA 1-2
Diferenciação pancreática e de ilhota. O complexo controle da diferenciação do pâncreas e seus três principais componentes – células acinares exócrinas, ductos e ilhotas de Langerhans – estão sendo elucidados por análise genética (A e B) [1–3]. No presente, são conhecidos apenas alguns dos fatores de transcrição envolvidos na transição do endoderme ao pâncreas e, então, aos tipos maduros de células pancreáticas; vários deles (BETA 2, Nkx 2,2, Nkx 6,1,ngn 3) estão também envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso. Um que é manifestamente necessário, mas não suficiente, é o pdx-1(ipf-1/stf-1/idx-1); sem ele, não há formação de pâncreas e, mais tarde, parece ser necessário para a diferenciação de células b. Tanto as células exócrinas quanto as de ilhotas diferenciam a partir do epitélio de ducto pancreático, mas ainda não foi respondida a pergunta se elas originam do mesmo pool de precursores ou, mesmo, se todas as células de ilhota partilham uma mesma linhagem celular. PP — polipeptídio pancreático. (Adaptado de Edlund [1].)

FIGURA 1-3
Vasculatura de ilhota e relações núcleo/manto. Um resumo diagramático de dados combinados provenientes de moldes obtidos por corrosão e das reconstruções seriadas de ilhotas de rato [2]. Nas ilhotas pequenas e grandes, as células b compõem o núcleo central, ao passo que as células não–b (células A, de polipeptídio pancreático e D) formam o manto circundante. As células A contendo glucagon são encontradas principalmente nas ilhotas do lobo dorsal do pâncreas, as células de polipeptídio pancreático são encontradas principalmente nas ilhotas do lobo ventral e as células D contendo somatostatina são encontradas nas ilhotas de ambos os lobos do pâncreas. Arteríolas curtas entram numa ilhota em descontinuidades do manto de células não–b e se ramificam nos capilares que formam uma estrutura glomeruliforme. Depois de atravessar a massa de células b, os capilares penetram no manto de células não-b quando o sangue sai da ilhota. Em ilhotas pequenas (diâmetro menor que 160 µm) (A), capilares eferentes atravessam o tecido exócrino antes de coaslecer em vênulas coletoras. Nas ilhotas grandes (diâmetro maior que 260 µm) (B), os capilares coalescem na borda da ilhota e percorrem o manto na forma de vênulas coletoras.

FIGURA 1-4

FIGURA 1-5

FIGURA 1-6
Tanto no desenvolvimento normal como em estudos experimentais, tornou-se patente que a população de células b de um pâncreas adulto é dinâmica e responde à demanda metabólica com alterações em massa e função, num esforço de manter uma euglicemia. A massa de células b pode se alterar por número de células e/ou tamanho celular. Dois mecanismos adicionam novas células b: diferenciação partir de células precursoras/células-tronco nos ductos (freqüentemente denominada neogênese) e replicação a partir de células b preexistentes [8]. Foi sugerido que a maioria dos tipos celulares tem um número limitado de replicações, após o qual é perdida a capacidade de responder aos sinais de replicação e, portanto, são então consideradas células senescentes (terminalmente diferenciadas). Estas células senescentes podem viver muito tempo e ser funcionais, provavelmente funcionando de maneiras diferentes das células replicativas mais jovens. Adicionalmente, assim como com todos os tipos celulares, as células b devem ter uma duração de vida finita e morrer por apoptose [9]. O turnover de células b implica que existem células b de diferentes idades em qualquer estágio do desenvolvimento. Células b adultas têm apenas uma baixa velocidade de replicação, mas esta velocidade acoplada ao nascimento de novas células b a partir dos ductos deve ser suficiente para contrabalançar a perda celular e acomodar a demanda funcional.

FIGURA 1-7
A região do promotor do gene da insulina mostrando os principais elementos "enhancer" (intensificador) e fatores de transcrição de ligação conhecidos. A expressão do gene da insulina é regulada por seqüências de pelo menos 4 kb a montante do sítio de início da transcrição (representado por uma seta e designado +1 bp) do gene da insulina. Em mamíferos adultos, a insulina é seletivamente expressa nas células b pancreáticas. Uma pequena região (de menos de 400 bp) do promotor da insulina que é altamente conservada nas várias espécies mamíferas é capaz de regular esta expressão seletiva e contém os principais elementos de controle da glicose. Esta região também pode recapitular a expressão do gene da insulina responsiva à glicose. Na figura, é mostrada a organização da porção proximal (-360 a +1 bp) do promotor da insulina. Elementos enhancer funcionalmente conservados são ilustrados como caixas. Novos nomes para esses elementos são mostrados dentro das caixas, enquanto nomes antigos são mostrados abaixo de cada caixa. Acima das caixas são mostrados os nomes dos fatores clonados que podem se ligar aos elementos correspondentes. Os elementos enhancer E1, A2-C1,A4-A3 e E2 foram implicados na expressão específica de célula b do gene da insulina. A expressão específica de tipo celular é mediada pela distribuição celular restrita dos fatores de transcrição (tais como BETA2, mMafA e PDX-1) que se ligam a esses elementos [10]. Além disto, esses elementos, juntamente com o elemento Za, são também responsáveis pela expressão do gene da insulina regulada pela glicose. Outros elementos enhancer, CRE/CCAAT e CORE, regulam a expressão do gene da insulina em resposta a outros sinais, como o cAMP (por meio da regulação da proteína cAMP Regulatory Element Binding [proteína de ligação a elemento regulatório responsivo ao cAMP]) e hormônio do crescimento ou leptina (via transdutor de sinal e ativador do fator 5 de transcrição [STAT]).

Além de seu papel regulador da expressão específica de célula e além de ser responsivo à glicose, os fatores de transcrição do gene da insulina estão envolvidos no desenvolvimento pancreático e diferenciação de células b. A falta de fatores de transcrição, como PDX-1, BETA2, PAX6 e HNF-1a e isl1, resulta em sua completa ausência ou em desenvolvimento pancreático anormal. Curiosamente, os seres humanos com um alelo mutante para PDX-1, BETA2 ou HNF-1a desenvolvem diabetes na juventude com início na maturidade, ao passo que indivíduos com mutações em ambos os alelos PDX-1 exibem agenesia pancreática. (Adaptado de Sander e German [11].

FIGURA 1-8
Vias de biossíntese da insulina. A glicose estimula a produção de pré-proinsulina através de efeitos sobre a transcrição e influências ainda mais fortes sobre a tradução. Pouco depois de seu início, a pré-proinsulina é clivada formando a proinsulina, que é então, transportada através do Golgi e empacotada em grânulos imaturos recobertos por clatrina, onde a proinsulina é adicionalmente processada, formando peptídios semelhantes à proinsulina, insulina e peptídio-C. Grânulos contendo insulina cristalizada podem permanecer em um compartimento de armazenamento, ser absorvidos em corpúsculos multigranulares onde são degradados pelo processo de crinofagia ou ser secretados através da via regulada da secreção, sendo a exocitose o evento final. Embora a grande maioria da insulina seja secretada através da via regulada, uma pequena quantidade pode ser liberada das microvesículas através da via da secreção constitutiva. (Veja as referências 12 e 13 para obter mais detalhes).

FIGURA 1-9
Processamento da proinsulina. A proinsulina é clivada por endopeptidases contidas nos grânulos secretores que agem nos dois sítios dibásicos, Arg31,Arg32 e Lys64,Arg65. PC2 é também conhecida como endopeptidase processador de proinsulina tipo II e PC3 é a endopeptidase tipo I. Após clivagem pela PC2 ou pela PC3, os aminoácidos dibásicos são removidos pela exopeptidase carboxipeptidase H (CP-H). A insulina e o peptídio-C são geralmente liberados em quantidades equimolares. Da imunorreatividade à insulina secretada, cerca de 2%–4% consiste em proinsulina e peptídios relacionados à proinsulina. Por ser o clearance destes peptídios na circulação consideravelmente mais lento que o da insulina, eles respondem por 10%–40% da imunorreatividade à insulina circulante. A proinsulina responde por cerca de um terço da imunorreatividade a peptídios semelhantes a proinsulina e a proinsulina clivada 'des 32-33' responde pela maior parte do restante, com a proinsulina clivada 'des 65-66' estando presente apenas em pequenas quantidade. No diabetes tipo 2, a razão entre peptídios semelhantes à proinsulina e insulina está aumentada, enquanto na TGD este achado é menos consistente. Acredita-se que a proporção aumentada de peptídios semelhantes à proinsulina se deve à depleção de grânulos maduros resultante da maior demanda secretória pela hiperglicemia, que leva à liberação do conteúdo incompletamente processado dos grânulos imaturos disponíveis [12,13]. (Adaptado de Rhodes [12].)

FIGURA 1-10
Etapas distais da secreção. Os grânulos secretores contendo insulina estão associados a microtúbulos e se movem até a superfície celular via interações adicionais com os microfilamentos da rede de actina cortical. Cálcio citosólico aumentado desempenha um papel crucial em várias etapas distais. Inicialmente, o cálcio se liga à calmodulina (CaM), que pode se ligar às CaM quinases. A CaM quinase II foi localizada nos grânulos secretores de insulina. Estas quinases podem então fosforilar proteínas, como a proteína-2 associada a microtúbulo (MAP-2 – microtubule-associated protein-2) e sinapsina I, que podem estar envolvidas na exocitose de microveísculas sinaptiformes (SLMV – synapticlike microvesicles). Elas também podem regular as proteínas centrais envolvidas na ancoragem ('docking') de grânulos, v-SNARES (sinapto- brevina [VAMP] e celubrevina) e t-SNARES (SNAP-25 e sintaxina). O complexo de ancoragem se liga à a-SNAP (soluble NSF attachment protein) e NSF (N- ethyl-maleimide-sensitive fusion protein), esta última apresentando atividade ATPásica que provavelmente permite a formação de grânulos competentes para fusão que são ativadas ('primed') para liberação como a primeira fase da secreção de insulina. (Adaptado de Easom [14].)

FIGURA 1-11
Estimulação pela glicose da secreção de insulina. A, Secreção de insulina do pâncreas isolado de rato perfundido. Nas concentrações de glicose menores ou iguais a 50 mg/dL, as taxas de secreção de insulina são bem baixas. Um desafio com uma alta concentração de glicose provoca um padrão bifásico de resposta insulínica [15]. B, Taxas comparativas de secreção de insulina e utilização de glicose em ilhotas de rato isoladas. A utilização de glicose foi mensurada pela conversão do glicose 5-tritiada em H₂O tritiada [16]. As curvas mostram a íntima relação entre as duas, exceto nas concentrações de glicose abaixo de 4 mmol. Relações semelhantes são encontradas entre secreção de insulina e oxidação de glicose, conforme mensuradas pela conversão de glicose marcada parra dióxido de carbono. (Adaptado de Leahy et al. [15].)

FIGURA 1-12
Mecanismos de secreção de célula b. A glicose entra na célula b através de um transportador facultativo de glicose que permite um rápido equilíbrio entre as concentrações extra e intracelular de glicose. Embora GLUT2 seja dominante em muitas espécies, GLUT1 pode ser mais importante em seres humanos. A glicose é fosforilada principalmente pela glicoquinase (GK), ao invés da hexoquinase (HK). O metabolismo aumenta a razão ATP/ADP através da oxidação via piruvato e pelo NADH que é levado para a mitocôndria pelos shuttles [17]. Os aumentos na razão ATP/ADP inibem o canal de potássio sensível ao ATP, que leva à despolarização e abertura de canais de cálcio voltagem dependentes (VDCC), com um importante aumento resultante no cálcio citosólico que dispara a exocitose. A secreção de insulina estimulada pela glicose é causada por dois mecanismos: a via de disparo, que é o canal de cálcio ATP-dependente, e a via de amplificação, que é o canal de potássio ATP-independente [17,18]. A base molecular desta última via é desconhecida. Os níveis de cálcio citosólico também podem ser aumentados pela liberação de cálcio do retículo endoplasmático. A glicose tem efeitos estimulantes sobre a secreção de insulina que são separados da despolarização, mas tais efeitos são pouco compreendidos. A secreção de insulina também pode ser estimulada por agentes como a acetilcolina (Ach) que, via receptores muscarínicos, trabalham através de mediadores lipídicos como o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). O peptídio-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) e o peptídio inibitório gástrico (GIP) são hormônios liberados do intestino com refeições que estimulam a secreção via adenilato ciclase e cAMP. Existem muitos outros agentes que influenciam a secreção de insulina.

FIGURA 1-13
Atividade elétrica da célula b de camundongo, induzida pela glicose. A, A atividade elétrica de uma célula b de camundongo contida em uma ilhota isolada induzida pela estimulação com glicose 11 mM. Quando a membrana se despolariza a cerca de -50 mV, ocorre a explosão, que é atividade elétrica periódica. Note o padrão bifásico da atividade elétrica, que pode estar relacionado com a primeira fase da secreção de insulina, mas é de duração mais curta, e é improvável que seja a explicação inteira. Quando a ção atinge cerca de -35 mV, ocorrem potenciais de ações, ou picos, que são melhor vistos na escala ampliada em B. Quando os níveis de glicose são muito altos (>22 mM), observa-se uma atividade contínua de picos. C, Comparações das oscilações de liberação de insulina e cálcio em uma única ilhota pancreática de camundongo durante estimulação em equilíbrio dinâmico com glicose 15 mM, sugerindo uma relação de causa e efeito. O cálcio foi mensurado com fluorescência de fura-2 carregada nas ilhotas. Os aumentos de picos de cálcio originam principalmente da entrada de cálcio extracelular através de canais de cálcio voltagem-dependentes de tipo L. A despolarização é causada principalmente pelo fechamento dos canais de potássio regulados por ATP [19]. (Painéis A e B adaptados de Atwater et al. [20]; painel C adaptado de Gilon et al. [21].)

FIGURA 1-14
Secreção pulsátil de insulina. A insulina é normalmente secretada em explosões secretórias coordenadas. Em seres humanos, os pulsos ocorrem a cada 10 minutos, aproximadamente. Em cães, eles ocorrem em freqüência um tanto maior, em intervalos de cerca de 7 minutos num estado basal. Embora as variações nos níveis periféricos de insulina sejam modestas, podem ser encontradas variações acentuadas na veia portal [22]. A pulsação basal é registrada durante um período de 60 minutos. Após uma ingestão oral de glicose (seta), que produz tanto um estímulo de glicose como um efeito 'incretina' ('incretin effect'), observa-se um aumento na amplitude das explosões, bem como um aumento na freqüência, com intervalos caindo de 7 para 5 minutos aproximadamente. Os mecanismos que controlam as oscilações não são conhecidos. A oscilação metabólica deve desempenhar um papel crucial, mas pode também haver algum tipo de rede neural que possa coordenar a comunicação entre as ilhotas em diferentes partes do pâncreas. (Adaptado de Porksen et al. [23].)

FIGURA 1-15
Influência de ácidos graxos sobre a função de célula b. É provável que o metabolismo de gordura tenha influências importantes sobre a secreção de insulina, mas os mecanismos responsáveis por esses efeitos ainda não são bem compreendidos. Parece que as modestas elevações de ácidos graxos livres (FFAs – free fatty acids) da obesidade contribuem para a hiperinsulinemia daquele estado. A depleção de FFAs circulantes, durante um jejum prolongado quando os níveis de glicose são baixos e as reservas lipídicas de células b estão depletadas, resulta em comprometimento da secreção de insulina convertido pelo citrato liase. Elevações excessivas de FFAs podem ter uma influência inibitória sobre a secreção de insulina. Parte da secreção de insulina estimulada pela glicose poderia ser mediada não apelas pelo metabolismo de glicose, mas também por mediadores de ácido graxo. Logo, aumentos no metabolismo de glicose poderiam produzir concentrações citosólicas aumentadas de citrato, que pode ser convertido pela citrato liase (CL) em acetil-CoA, que pode ser transformado em malonil-CoA pela acetil-CoA carboxilase (ACC). O malonil-CoA pode inibir a carnitina palmitoiltransferase I (CPT I), que ajuda a contro-lar a entrada de acil-graxo-CoA nas vias de oxidação de ácidos graxos da mitocôndria. Com a inibição da entrada de acil-graxo-CoA na mitocôndria, poderiam ser gerados no citoplasma os mediadores de ácido graxo que poderiam influenciar a secreção de insulina. Os ácidos graxos que entram na célula b poderiam ser convertidos em mediadores de ácido graxo, que podem agir sobre os canais de íons, quinases ou através de outros mecanismos para estimular a exocitose da insulina. Alguns dos mediadores lipídicos são o fosfolípide inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e o diacil-glicerol (DAG), que podem agir via proteína quinase C. Alternativamente, os ácidos graxos podem ser armazenados como triglicérides (TG) para uso em épocas de falta de combustível. Sob certas circunstâncias, a oxidação de ácidos graxos pode contribuir para a formação de ATP e, portanto, ajudar a fechar o canal de potássio sensível ao ATP (K+ATP), resultando em despolarização e abertura dos canais de cálcio voltagem-dependentes (VDCC).TCA — ciclo dos ácidos tricarboxílicos. (Adaptado de McGarry e Dobbins [24] e Prentki e Corkey [22].)

FIGURA 1-16
Efeitos do sistema nervoso autônomo, hormônios intestinais, aminoácidos e fármacos sobre a secreção de insulina. O ramo parassimpático do sistema nervoso autônomo tem uma influência estimulante sobre a secreção de insulina, exercida pela acetilcolina que age principalmente através da fosfolipase C (PLC) para gerar mediadores de inositol fosfato e diacilglicerol (DAG). A estimulação parassimpática também leva à liberação do mediador peptídico peptídio intestinal vasoativo (VIP – vasoactive intestinal peptide), que intensifica a secreção via proteínas G estimulantes (G^S) que agem através da adenilato ciclase (AC). O sistema nervoso simpático inibe a secreção de insulina, com a adrenalina e a noradrenalina, tendo um efeito negativo sobre a AC através das proteínas G inibitórias (G^I ). O mediador peptídico simpático galanina e a somatostatina têm efeitos inibitórios sobre a secreção de insulina através de mecanismos similares. Os hormônios intestinais GLP-1 e peptídio inibitório gástrico (GIP – gastric inhibitory peptide) estimulam a secreção de insulina através de cAMP e proteína quinase A (PKA). As sulfoniluréias estimulam a secreção de insulina agindo sobre o receptor de sulfoniluréia (SUR – sulfonylurea receptor) para fechar o canal de potássio sensível ao ATP, que causa despolarização. O diazóxido tem um efeito oposto que leva à hiperpolarização, que é inibitória. Os aminoácidos estimulam a secreção de insulina por vários mecanismos. A arginina é carregada positivamente, produzindo despolarização quando transportada para dentro de células b, mas este não é um mecanismo importante nas concentrações fisiológicas da arginina. A leucina pode influenciar a secreção de insulina por ser oxidada via acetil CoA ou através de um efeito metabólico mais complexo mediado pelo glutamato desidrogenase (GDH). IP3 — inositol 3 fosfato; IP3R — receptor do inositol 3 fosfato.

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